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耐鹽菌株在環(huán)氧廢水中的降解特性

環(huán)氧樹脂生產(chǎn)廢水中含有大量的NaCl,極大地干擾了生化處理,處理難度和成本都很高。這是一種典型的高鹽難降解工業(yè)廢水。目前,這類高鹽廢水的處理方法主要有物理化學(xué)法、生物法和物化-生化組合法。自然界中的耐鹽細(xì)菌生活在鹽湖、鹽堿湖和海水中,對(duì)鹽度的耐受性可達(dá)20%。這些耐鹽細(xì)菌的存在為高鹽廢水的生物處理提供了可能。近年來,耐鹽細(xì)菌被應(yīng)用于高鹽廢水如榨菜廢水、高鹽皂化廢水的處理,耐鹽細(xì)菌的篩選成為生化處理的關(guān)鍵步驟。本研究從廢水生化處理系統(tǒng)的活性污泥中分離篩選耐鹽細(xì)菌,并對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定和生長特性研究,以探討耐鹽細(xì)菌在環(huán)氧樹脂廢水中的降解特性,從而為此類含鹽樹脂廢水的處理提供技術(shù)支持。

1.材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用水取自上海某化工廠生產(chǎn)環(huán)氧樹脂的混合廢水,經(jīng)Fenton氧化預(yù)處理后稀釋,并添加適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)物質(zhì)。水質(zhì)見表1。

細(xì)菌來源:上海某化工廠和某鎮(zhèn)污水處理廠生化處理系統(tǒng)的活性污泥。

無機(jī)鹽介質(zhì):硫酸鎂& # 8226;7H2O0.2g克/升,KH2PO40.5g克/升,NH4Cl0.5g克/升,K2HPO41.5g克/升,NaCl(5 ~ 200克/升,根據(jù)需要調(diào)整),微量元素溶液1毫升。微量元素:CoCl22g/L,NiCl & # 822626H2O0.05g/L,ZnCl20.05g/L,CuCl20.03g/L,F(xiàn)eCl & # 82263H2O 2g/L,MnCl20.5g/L,EDTA1g/L,pH 7.0。

斜面培養(yǎng)基:蛋白胨10g,牛肉醬5g,NaCl5g,KH2PO42g,NH4Cl1g,蒸餾水1000mL,瓊脂20g,pH 7.0。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1耐鹽菌株的篩選

通過逐漸增加NaCl濃度來篩選和培養(yǎng)耐鹽細(xì)菌。從上述兩種污泥中各取2.5g,加入裝有100mL無菌水的已滅菌的250mL三角瓶中,加入無菌水質(zhì)量0.01%的焦磷酸鈉,搖床破碎微生物群。用無菌移液管吸取上述泥水混合物,在37℃、150r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)72小時(shí),然后轉(zhuǎn)移到5% NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中(每代3組平行實(shí)驗(yàn),傳至第10代)進(jìn)行馴化,直到無機(jī)鹽培養(yǎng)基中NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到15%,馴化完成。將馴化后的菌株接種到含有環(huán)氧樹脂生產(chǎn)廢水(COD1000mg/L)的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,37℃搖床培養(yǎng)72h,得到目標(biāo)菌株。放映結(jié)束了。

分離出的單菌落用涂布瓊脂平板分離,然后將瓊脂平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中72h。瓊脂平板上的菌種長成菌落后,接種保存在斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行增菌,保存在4℃冰箱中備用。

經(jīng)典分類學(xué)和16SrDNA序列分析用于確定菌株的分類和屬。對(duì)選取的活化菌株進(jìn)行測序,并在Genebank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì),得到較為接近的典型菌株的16SrDNA基因序列。用ClustalX1.8軟件對(duì)與數(shù)據(jù)庫中高度相似的典型菌株進(jìn)行序列比對(duì),用MEGA6.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.2菌株生長曲線

2菌株生長曲線無機(jī)鹽培養(yǎng)基的鹽度梯度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))用NaCl調(diào)至2%、4%、6%、10%,pH用NaOH溶液精確調(diào)至7.0。將富集的菌株在液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜,然后將10mL菌懸液接種到100mL含不同濃度NaCl的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,在搖床中37℃恒溫好氧培養(yǎng)。每2小時(shí)對(duì)菌液OD600取樣。

上述培養(yǎng)基和藥物在121℃滅菌30分鐘備用。

1.2.3耐鹽復(fù)合菌劑量比的確定

通過對(duì)上述耐鹽細(xì)菌的篩選,得到耐鹽細(xì)菌X1、X2、X3,每個(gè)菌懸液的OD600保持在1.2左右,規(guī)定每1mL菌懸液為1份。根據(jù)正交試驗(yàn)表,將菌懸液按所需比例組合,在50mL廢水中加入5mL復(fù)合菌懸液,在生物搖床中37℃培養(yǎng)24h。測定了水中的COD,考察了各種組合比例的廢水處理效果,確定了較好的比例。

1.2.4添加耐鹽復(fù)合菌的生物處理

Fenton氧化預(yù)處理后,將環(huán)氧生產(chǎn)混合廢水調(diào)節(jié)至合適的鹽度,并補(bǔ)充合適的營養(yǎng)物質(zhì)。將50mL處理后的廢水加入250mL三角瓶中,根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)條件加入耐鹽復(fù)合菌懸液,考察廢水中COD的去除情況。

1.3分析方法

OD600用UV-4802H紫外分光光度計(jì)測定,CODCr用HZ-HJ-SZ-0108測定,氨氮用HJ 535-2009測定,pH用pHS3C酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠)測定。

2.結(jié)果和討論

2.1耐鹽菌株的篩選

經(jīng)過對(duì)兩種混合活性污泥的馴化、篩選、富集培養(yǎng)、分離純化,篩選出三株耐鹽細(xì)菌,分別命名為X1、X2和X3。與GenBankBlast軟件的序列同源性比較顯示,三個(gè)菌株均表現(xiàn)出較高的同源性,基于16SrDNA序列分析的進(jìn)化樹如圖1所示。菌株X1被鑒定為產(chǎn)堿桿菌,菌株X2被鑒定為假單胞菌,菌株X3被鑒定為耐鹽芽孢桿菌。

2.2耐鹽菌株的生長曲線

分別以菌液OD600為縱坐標(biāo),培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),繪制了三個(gè)耐鹽菌株的生長曲線,如圖2所示。

從圖2中可以看出,X1和X2可以在2%~10%的NaCl中生長,X3可以在2%~6%的NaCl中生長,但鹽度對(duì)該菌株的生長速度影響很大。隨著鹽度的增加,菌株生長曲線的適應(yīng)期變長,對(duì)數(shù)生長期的增長速度變慢。適應(yīng)期較長的原因是微生物在不同鹽度環(huán)境中接種后,需要一定時(shí)間的調(diào)整和適應(yīng),合成多種酶進(jìn)一步完善體內(nèi)酶系統(tǒng)后才會(huì)生長繁殖。而在高鹽環(huán)境下,酶的合成速率下降,產(chǎn)生新的酶系統(tǒng)需要一定的時(shí)間。在對(duì)數(shù)生長期,微生物雖然處于營養(yǎng)過剩狀態(tài),但在對(duì)數(shù)生長期生長速度變慢。在高鹽環(huán)境中,微生物需要花費(fèi)大量的能量來調(diào)整自己的代謝途徑,或者分泌胞外聚合物來抵抗外界的不良環(huán)境因素,同時(shí)也需要能量來合成自身生長所需的物質(zhì)。因此,用于生長和繁殖的能量相對(duì)減少,自我生長率降低,世代時(shí)間延長。減速生長期延長可能是由于底物利用率降低,微生物存活率低,導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)過剩。

2.3耐鹽復(fù)合菌的生物處理

2.3.1耐鹽復(fù)合菌劑量比的確定

研究表明,利用優(yōu)勢菌株(如耐鹽細(xì)菌)降解有機(jī)污染物已成為一種有效的方法,微生物菌群處理有機(jī)物的效率高于單一菌株。因此,通過正交試驗(yàn)對(duì)分離的3株耐鹽細(xì)菌確定了X1、X2和X3的組合比例,從而獲得能夠高效處理環(huán)氧樹脂生產(chǎn)廢水的復(fù)合耐鹽細(xì)菌。正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

從表2可以看出,最佳水平組合為A2、B2和C3,因此三種耐鹽細(xì)菌X1: X2: X3的最佳用量比為2: 2: 3(體積比)。

2.3.2耐鹽組合菌對(duì)Fenton預(yù)處理廢水的降解效果

實(shí)驗(yàn)固定了四個(gè)因子,調(diào)整了另一個(gè)因子,考察廢水中COD的去除效果,如表3和圖3所示。

(1)鹽度。從圖3(a)可以看出,當(dāng)NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%~8%時(shí),組合耐鹽菌對(duì)廢水中有機(jī)物的降解效果在80%以上。當(dāng)NaCl濃度為15%時(shí),COD去除率急劇下降,這是因?yàn)殡S著鹽度的增加,菌株的生長速度變慢,酶的合成受到限制,有機(jī)物的降解速度變慢。因此,組合微生物的最適NaCl濃度為5%~8%。

(2)反應(yīng)時(shí)間。從圖3(b)可以看出,生物搖床在37℃反應(yīng)6h,廢水中COD的去除率達(dá)到54%,12h后去除率約為70%,24h后去除率提高了3%。隨著接觸時(shí)間的延長,12~48h后COD去除率仍保持在80%以下。

(3)溫度。在圖3(c)中,廢水的COD去除率隨著溫度的升高而逐漸增加,在37℃時(shí)達(dá)到約91%的較大值。當(dāng)溫度達(dá)到40℃時(shí),COD去除率反而下降,主要是因?yàn)楦邷貢?huì)抑制微生物的活性,從而降低廢水的COD去除率。因此,耐鹽細(xì)菌組合降解有機(jī)物的最適溫度為37℃。

(4)pH值.圖3(d)表明,當(dāng)pH為7時(shí),廢水的COD去除率較為理想,達(dá)到85%左右;當(dāng)pH值為5和6時(shí),COD去除率分別為73%和65%左右;當(dāng)pH為9時(shí),COD去除率僅為30%左右。因此,耐鹽組合菌對(duì)COD的去除效果在pH 7時(shí)較為理想,pH過低或過高都會(huì)影響微生物的活性,降低有機(jī)物的降解速率。

(5)細(xì)菌的用量。從圖3(e)可以看出,廢水中COD的去除率隨著細(xì)菌投加量的增加而增加。細(xì)菌投加量為5%的廢水COD去除率明顯高于細(xì)菌投加量為3%的廢水。當(dāng)細(xì)菌投加量為5%和10%時(shí),COD去除率分別為80%和94%。當(dāng)細(xì)菌投加量為12%時(shí),COD去除率為98%,但與10%相比降解率有限,因此細(xì)菌的最佳投加量為10%。

綜上所述,在適合耐鹽細(xì)菌生長的環(huán)境下,用其處理Fenton預(yù)處理后的廢水,COD去除率可維持在70%~80%。通過單因素實(shí)驗(yàn)確定了最佳實(shí)驗(yàn)條件:pH值為7,反應(yīng)時(shí)間為24h,反應(yīng)溫度為37℃,廢水中NaCl濃度為5%~8%,耐鹽復(fù)合菌的最佳投加量為廢水體積的10%。

3.結(jié)論

(1)對(duì)環(huán)氧樹脂生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)和城鎮(zhèn)污水處理生化池中的活性污泥進(jìn)行馴化,篩選出3株耐鹽細(xì)菌,命名為X1、X2和X3,它們能高效降解廢水的COD,并能在高鹽度環(huán)境中良好生長。采用16SrDNA序列分析方法進(jìn)行鑒定,分離篩選出3株耐鹽菌株,分別為X1產(chǎn)堿桿菌、X2假單胞菌和X3芽孢桿菌。

(2)通過正交試驗(yàn),確定三株菌的最佳劑量比為2: 2: 3(體積比)。用該組合菌處理含鹽量為5%~8%的Fenton廢水時(shí),耐鹽組合菌的最佳投加量為廢水體積的10%,搖床反應(yīng)時(shí)間為24h,pH值為7,溫度為37℃,能保持較高的COD去除率。(來源:中海油天津化工研究設(shè)計(jì)院有限公司)


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